美国栗子项目
美洲板栗组织培养与转化
美洲板栗组织培养
植物组织培养(又称微繁)是植物繁殖的一种方法 无菌条件下无性繁殖. 微繁的四个主要步骤是:建立; 繁殖、生根和驯化. 另一个步骤，再生，是 胚胎组织培养所需. 下面说明组织培养的过程 对美洲板栗体细胞胚胎(由合子建立的非合子胚胎) 细胞). 所有步骤都在层流罩中进行，该罩使用HEPA过滤器 保持空气无菌. 整个过程可能需要12到18个月.
- 美洲板栗项目，描述板栗组织培养和转化 (视频)
建立
为了在组织培养中建立美洲板栗体细胞胚，将板栗坚果去除
然后用漂白剂消毒去除微生物. 的
将清洗干净的坚果切开，取出胚珠，置于胚胎起始阶段
培养基(一种半固体的凝胶，包含所有必需的矿物元素
植物通常会从土壤中获得维生素、糖和激素)
培养皿中. 几周后，许多胚胎要么被污染，
死亡或形成不能再生的愈伤组织. 然而，有些胚胎会
开始成长. 存活下来的体细胞胚胎现在可以繁殖了.
乘法
胚胎一旦形成，就可以繁殖. 通过使用某种组合
如果培养基中有激素，新的胚胎就会从原来的胚胎开始生长. As
更多的胚胎发育，培养基中的营养耗尽. 新的胚胎
被分成小组并转移到新鲜培养基上. 每两到三次
几周后，随着更多的胚胎生长，它们被分离并转移到新鲜培养基中.
再生
下一步是将胚胎再生成芽. 要做到这一点，浓度
营养物、糖和激素在培养基中发生了变化. 总共有三个
在此过程中使用的不同介质. 一旦嫩芽发育，它们就会繁殖
在另一种媒介上. 嫩枝被切成小段，然后转移到
新鲜培养基每月一次.
加油
当幼苗长到大约2到3英寸高时，它们就可以生根了.
将它们浸入一种生根激素的液体溶液中，然后放入
黑暗四天. 10%到60%的芽都会经历这个过程
过程会产生根. 这些有根的植物被放入盆栽混合物中，然后它们
经历一个适应环境的过程.
适应环境
这已被证明是美洲板栗组织培养中最困难的部分.
这些植物对轻微的环境变化非常敏感，在高温下会死亡
错误的情况. 这些植物被放置在一个受控环境的生长室内
用袋子盖住它们，以重现它们在纸巾中习惯的高湿度
文化. 袋子被分阶段移除，让植物适应较低的温度
湿度慢慢. 需要时给它们浇水和施肥. 40%到60%
经过驯化的植株中有一半存活下来并在田间种植.
美洲板栗转化
将潜在的抗枯萎病基因添加到美洲栗树基因组中，一种方法
被称为 农杆菌属正在使用-中介转换. 这种方法使用一种叫做 根癌土壤杆菌这是一个天生的基因工程师. 野生型 农杆菌属 生活在土壤中，寄生在许多植物根颈附近的小伤口上.
当 农杆菌属 遇到伤口，它会附着在植物细胞上，在上面戳一个微小的洞
并注入小片段的DNA. DNA移动到细胞核并被合并
进入植物的染色体. 野生型 农杆菌属 注入基因，使植物细胞迅速分裂，产生疣状的瘿，
并生产出只有 农杆菌属 可以使用. 科学家已经“驯服”了 农杆菌属 这样他们就可以插入研究项目感兴趣的基因，而不是
只对细菌有利的基因.
为了改造美洲栗子体细胞胚胎，我们用这个 农杆菌属-中介变换法. 这意味着我们使用“解除武装”的菌株 农杆菌属 含有我们假定的抗性增强基因和选择性标记基因. 最初, 我们使用了一个编码绿色荧光蛋白(GFP)的可评分标记基因来帮助 制定我们的协议. 我们现在能够在没有绿色荧光蛋白基因的情况下改造栗子. 要执行转换，则 农杆菌属 在试管中与栗子胚胎混合在一起. 胚胎被放置 在干燥板上(无菌培养皿，滤纸稍湿润) 细菌有足够的时间将设计好的DNA注入植物细胞. 然后将胚胎转移到含有抗生素的培养基中，抗生素可以杀死细菌 但不是植物细胞. 一周后，胚胎被转移到定期浸泡 含抗生素液体培养基的生物反应器. 抗生素会消除 植物细胞没有吸收新的DNA，但不会伤害转化的细胞. 被转化的胚胎然后再生成完整的植物(见 上图). 用这种方法转化的第一批美国栗子含有草酸盐 源自小麦的氧化酶基因(见下文).
我们的平均转换效率从20个转换事件中提高了 我们在2006年报道过每克大约有170个稳定的胚胎发生转化 2013年每克体细胞胚组织的事件数. 我们已经改造了325个人 使用36种不同基因结构的胚胎发生事件. 接近100个这样的事件 携带23种不同基因结构的植物已经再生成整株植物. 截至2013年秋天，我们已经在8个地点种植了1275棵转基因栗树 纽约州和弗吉尼亚州各有一个. 根据田间试验接种，温室 小茎接种和离叶试验，三种转基因产生更强 对板栗疫病的抗性比非转基因美洲板栗强. 这种抗性大约介于美洲板栗和板栗之间 等于甚至高于板栗的天然抗性， 取决于转基因和事件.
上面的图片显示了接种培养基的过程 农杆菌属 (图. 1)，与栗子胚共培养农杆菌(图2). 2),浆果, 的 农杆菌属/胚混合，然后将胚转移到Agro Kill培养基上(图2). 3)，最后 利用周期性浸渍生物反应器筛选转基因胚胎团块(图2). 4). 然后胚胎繁殖并再生成完整的植物 在上述过程中.
- 美洲栗树延长采访 (视频)
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Polin L.D., H. 梁,R. Rothrock, M. Nishii D. 发,. 纽豪斯,C.J. 奈恩,W.A. 鲍威尔和C.A. 梅纳德. 2006. 农杆菌属-介导的美洲板栗(齿栗叶dentata (沼泽.) Borkh.)体细胞胚胎. 植物细胞、组织和器官培养. 84: 69-79
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